Перспективы применения кверцетина в онкогинекологии

Механизмы противоопухолевого действия кверцетина

Особенности противоопухолевого действия кверцетина обуславливается его влиянием на различные звенья клеточного цикла опухолевых клеток.

Регуляция мутаций белка р53

Мутации белка р53 являются одними из наиболее распространенных генетических аномалий у людей с онкологическими заболеваниями(24), он наблюдается в 50% случаев злокачественных опухолей. Столь высокие цифры объясняют второе названия данного белка – «страж» генома, поскольку считается, что он обладает способностью тормозить образование злокачественных клеток.

Было установлено, что кверцетин (в дозе 248 мкМ) регулирует биосинтез мутантного белка р53, практически останавливая его в клетках рака молочной железы(21). Более низкие концентрации кверцетина приводили к меньшему сокращению биосинтеза. Нисходящая регуляция была гораздо слабее в клетках без мутаций генома р53(23).

Прекращение клеточного цикла в фазе G₁

Фаза клеточного цикла G₁, контролируемая геном р53, является основным этапом контроля клеточной пролиферации (21).

Эксперимент, который проводился на человеческих Т-клетках лейкемии, показал, что на фоне действия кверцетина в конце фазы G₁клеточного цикла происходит апоптоз.

Под действием кверцетина в концентрации 70 мкМ в разных фазах клеточного цикла развивался апоптоз лейкозных клеток у 50-64% клеток. Прекращение клеточного цикла в фазе G₁ наблюдалось также в человеческих клетках карциномы желудка. Было установлено, что при концентрации кверцетина 70 мкМ, репликация ДНК уменьшалась на 14%, что приводило к задержке клеточного деления. Этот эффект был обратимым - после удаления кверцетина деление опухолевых клеток возобновлялось (25). Исследователи пришли к выводу, что в концентрации 70 мкМ кверцетин приводит к 10% снижению роста опухолевых клеток (21).

Ингибирование тирозинкиназ

Тирозинкиназы представляют собой семейство белков, расположенных в пределах клеточной мембраны, участвующих в передаче сигналов в клетке. У пациентов с прогрессирующим раком, внутривенное введение кверцетина (дозы 60-1700 мг/м2) привело к торможению активности тирозинкиназ лимфоцитов в девяти из одиннадцати случаев. Продолжительность этого эффекта наблюдалась в течение часа. Это торможение было замечено также и через 16 часов после введения кверцетина (21). Лабораторные эксперименты подтвердили эти результаты как клеток доброкачественных, так и злокачественных опухолей.

Считается, что тирозинкиназы участвуют в онкогенезе путем перераспределения контроля регуляции клеточного роста (26). Поэтому препараты, избирательно воздействующие на тирозинкиназы, применяются при определенных видах рака в качестве потенциальных химиотерапевтических агентов, без цитотоксических побочных эффектов, наблюдаемых при обычной химиотерапии. Кверцетин был первым таким препаратом, прошедшим фазу I клинических испытаний (26).

Способность связывать рецепторы эстрогена

Рецепторы эстрогена второго типа ER II, присутствуют как в нормальной ткани, так и во многих типах опухолей, включая рак груди, яичников, толстой кишки, меланому и лейкемию. Активность ER II не зависит от статуса рецепторов эстрогена I типа(21). Роль рецепторов эстрогена II типа (ER II) in vivo не ясна до конца. Способность кверцетина связывать рецепторы может объясняться тем, что данные рецепторы предназначены для флавоноидов, способных ингибировать клеточных рост.

Кверцетин индуцирует экспрессию рецепторов ER II во всех типах человеческих клеток эстроген позитивного рака молочной железы. Подобное действие аналогично тамоксифену и диэтилстильбэстролу, кверцетин оказывает в клетках меланомы. Концентрация, необходимая для ингибирования роста на 50% одного клона клеток для кверцетина была ниже(7 нМ), чем для тамоксифена (9 нМ)(28).

Ингибирование белков теплового шока

Было установлено, что кверцетин ингибирует синтез белков теплового шока в клетках нескольких злокачественных опухолей, в том числе при раке молочной железы, лейкемии и раке толстой кишки. Белки теплового шока образуют комплекс с мутантным р53, который позволяет опухолевым клеткам «обойти» обычные механизмы клеточного цикла. Белки теплового шока также позволяют улучшить выживаемость опухолевых клеток при различных нарушениях жизнедеятельности (плохое кровообращение, температура и др.), и связаны с сокращением выживаемости и рефрактерности к стандартным химиотерапевтическим препаратам, используемым при раке молочной железы (21).

Ингибирование экспрессии Ras - белков

Мутации в протоонкогенах Ras обнаружены в более чем 50% случаев при раке толстой кишки и других типах опухолей. Было выявлено, что кверцетин (10 мкМ) ингибирует экспрессию p21-RAS онкогена в культивируемых клеточных линиях рака толстой кишки (21).

Кверцетин и рак молочной железы (РМЖ)

Одним из глубоких исследований в отношении воздействия кверцетина на клетки РМЖ, проведенного в 2009 г было исследование J.Jeong at al (2).

Дизайн исследования:

Человеческие клетки карциномы молочной железы (КМЖ) SK-Br3, MDA-MB-453, и MDA-MB-231 были инкубированы в специальной среде (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) с 10 фетальной сыворотки (HyClone, Logan, UT). Клетки КМЖ MCF-10A инкубировали в DMEM и среде Ham's F12 (1:1) с 5% лошадиной сыворотки, 20 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 мг/мл инсулина, 500 нг/мл гидрокортизона, and 100 нг/мл эндотоксина холеры (11). В диметилсульфоксиде были растворены кверцетин и ингибитор Chk2 , после чего данный раствор добавили к среде, в которую были погружены опухолевые клетки.

Для того чтобы определить, имеет ли кверцетин в клинических дозах химиопрофилактические эффекты в отношении РМЖ, к клеткам КМЖ SK-Br3 каждые 24 часа добавляли новую порцию кверцетина - до достижения клинической дозы. Исследователи пришли к выводу, что кверцетин ингибирует пролиферацию клеток КМЖ (SK-Br3) в зависимости от дозы(2).

Потенциальный эффект угнетения кверцетином другой культуры клеток КМЖ (MDA-MB-453) также подтвердился. Интересной находкой оказался тот факт, что концентрация кверцетина 10мг\мл не оказывала влияния на пролиферацию здоровых клеток эпителия молочной железы (MCF-10A). Эти результаты продемонстрировали избирательную антипролиферативную активность кверцетина в отношении клеток РМЖ. Исследователи задались целью определить механизмы такой активности, и оказалось, что причиной ее является не только цитотоксичность кверцетина.

Подтвердилась гипотеза о том, что кверцетин ингибирует клеточный цикл опухолевой клетки. Клетки КМЖ (SK-Br3) подвергались воздействию кверцетина в дозе 0-10 мкм в течение 2-4 дней, после чего было проведено измерение дистрибуции клеточного цикла путем измерения содержания ДНК с помощью маркировки соединением йода. В результате наблюдался значительный прирост популяции клеток КМЖ (SK-Br3) в фазе G0/G₁ - и значительное снижение их количества в фазе S. После 4 дней воздействия кверцетина популяция в фазе G0/G₁ выросла с 61.8% до 70.7% (5 мкм) и 75.9% (10 мкм), а популяция в фазе S уменьшилась с 30.2% до 21.4% (5 мкм) и 18.2% (10 мкм). Популяция опухолевых клеток в фазе G2/M не претерпела существенных изменений под влиянием кверцетина. Субпопуляция G₁выросла до 6.4% и 9.2% после 2х и 4хдневного воздействия кверцетина соответственно (в дозе 10мкм), что демонстрирует тот же уровень цитотоксичности.

Исследователи пришли к выводу, что мощнейший потенциал антипролиферативной активности кверцетина в отношении РМЖ обеспечивается не только за счет цитотоксического эффекта, но главным образом за счет прекращения цикла опухолевых клеток в фазе G₁ (2).

Кверцетин и рак яичников

Фаза 1 клинического исследования эффективности кверцетина in vivo при раке яичников у людей продемонстрировала существенное снижение уровня онкомаркера яичников СА-125 ( с 295 до 55 ед\мл) у пациентки с раком яичников, рефрактерным к стандартной химиотерапии цисплатином (1). Пациентке было проведено два курса внутривенной терапии кверцетином, целью которых было также определение эффективной клинической дозы кверцетина для внутривенного введения (12). Концентрация кверцетина 420 mg/m2 оказалась эффективной в терапии этого вида рака.

Терапия была продолжена в течение шести месяцев, и во время этого периода стало возможным снижение дозы карбоплатина. Далее было зафиксировано постоянное снижение опухолевого маркера СА-125 (без упоминания о динамике в размерах опухоли)(21).

Кверцетин и рак эндометрия (РЭ)

Роль кверцетина в терапии этого вида рака изучена менее всего. Однако японские исследователи вплотную занимались изучением антипролиферативного эффекта кверцетина в отношении клеток рака эндометрия на протяжении последних 10 лет. Данные их исследований показывают, что активность кверцетина в отношении клеток РЭ обусловлена как влиянием его на жизненный цикл опухолевых клеток, так и ингибицией генов – факторов роста опухолевой клетки.

При воздействии кверцетина в концентрации 1,10 и 100мкм на клетки Исикавы (клетки рака эндометрия) подробно изучались механизмы пролиферации этих клеток, экспрессия сигнальных генов роста (EGF, VEGF, TGF-alpha), и генов апоптоза (bcl-2 and bax), а также генов-регуляторов клеточного цикла (p53, p21, p73, и циклин D1)(1,8). После 7-дневного воздействия указанных доз кверцетина на клетки РЭ, отмечалось торможение роста данных клеток на 3,51 и 87% соответственно. Данные экспрессии генов и протеинов продемонстрировали, что кверцетин в дозе 100мкм существенно снижал уровни сигнальных генов роста - EGF и циклина D1, при этом отмечалась восходящая регуляция VEGF. На экспрессию других генов, а именно TGF-alpha, p53, p21, p73, bcl-2 и bax в опухолевых клетках РЭ кверцетин существенно не повлиял.

На основании этого и ряда других испытаний, японские исследователи сделали заключение, что кверцетин в клинических дозах 10-100мкм способен угнетать пролиферацию клеток рака эндометрия за счет нисходящей регуляции EGF и циклина D1(8).

Комбинированная терапия с другими химиотерапевтическими агентами

Многочисленные данные исследований in vitro свидетельствуют, что кверцетин снижает резистентность опухолевых клеток к некоторым стандартным химиотерапевтическим комбинациям (13-19). Кроме того, кверцетин обладает синергическим действием с некоторыми химиотерапевтическими агентами (20). Кверцетин увеличивает цитотоксическую активность цисплатина in vivo и in vitro. Интраперитонеальное введение кверцетина в дозе 20мг\кг масс тела вместе с цисплатином в дозе 3 мг\кг массы тела приводило к существенному снижению роста опухолей у мышей по сравнению с монотерапией цисплатином или кверцетином(4). Исследование in vitro на культурах человеческих клеток рака яичника и рака эндометрия показало, что добавление 0,1-10м\моль кверцетина к монотерапии цисплатином приводило к 1,5-30-кратному увеличению эффекта от терапии цисплатином (5), а добавление тех же доз кверцетина к стандартному режиму терапии адриамицином (7) приводило к дозозависимому увеличению цитотоксичности при РМЖ, резистентном к другим линиям терапии.

Кроме того, кверцетин в дозах от 10 до 100м\моль in vitro обеспечивал протективный эффект в отношении нефронов от токсичности цисплатина(6)

В исследованиях 2013г было показано синергическое действие кверцетина и тамоксифена в виде капсул для комбинированной пероральной терапии. Данные капсулы содержали тамоксифен и кверцетин в соотношении 2 : 1, с размерами частиц 185.3 ± 1.20 нм, PDI 0.184 ± 0.004, эффективностью захвата 67.16 ± 1.24% для тамоксифена, 68.60 ± 1.58% для кверцетина(3). Комбинация продемонстрировала большую эффективность, чем монотерапия любым из препаратов за счет увеличения клеточного захвата, цитотоксичности и обеспечения локализации комбинации Tmx-QT-NPs в ядрах опухолевых клеток MCF-7 ,а также 3-5 кратное увеличение биодоступности обоих препаратов.

Соответственно, комбинированная терапия тамоксифен\кверцетин, согласно выводам исследователей, обеспечивает существенно более высокую супрессию опухолевых клеток, чем монотерапия.

Помимо исследования in vitro, эффективность данной комбинации была подтверждена в экспериментальных моделях РМЖ у самок мышей. Комбинированная терапия обеспечивала эффективный контроль ангиогенеза опухолей, что подтверждалось нормализацией уровня маркеров MMP-2 и MMP-9. Было доказано, что комбинация тамоксифен\кверцетин обладает абсолютной безопасностью, не имея выраженной гепатотоксичности или прооксидантных свойств по сравнению с монотерапией любым из данных препаратов. Исследователи пришли к выводу, что комбинированная терапия тамоксифеном и кверцетином может являться очень перспективным клиническим направлением в лечении РМЖ.

Безопасность кверцетина как химиотерапевтического агента

Еще в 1999 г Международное Агентство по исследованию Рака (IARC) опубликовало заключение о том, что кверцетин не имеет канцерогенного потенциала и не может быть классифицирован как карциноген для человека(22). Однако в начале XXI века на основании единичных исследований высказывались предположения о потенциальной канцерогенности кверцетина (21). В рамках Национальной программы по токсикологии США (НТП) были проведены исследования канцерогенности флавоноида в течение 728 дней путем добавления 4% (1900 мг / кг) кверцетина в рацион крыс F344 / N. Исследователи сообщили о росте аденом почек (почечных канальцев) у мужской половины особей, получавших 4% кверцетин по сравнению с контрольной группой (8/50 по сравнению с 1/50). У женских особей данные изменения не были отмечены. Однако эти данные были подвергнуты критике на том основании, что рост доброкачественных опухолей был отмечен только на последующих этапах эксперимента, что повлияло на чистоту результатов. Эти исследования также продемонстрировали снижение роста фиброаденом молочных желез у подопытных животных (9/50 в высоких дозах по сравнению с 29/50)(21). Кроме данного наблюдения не было отмечено никаких других эпизодов роста опухолей, связанных с квертицином. В настоящее время кверцетин не классифицируется в докладе НТП, как канцероген. Кроме того, в исследованиях у людей кверцетин также продемонстрировал высокий профиль безопасности. У здоровых добровольцев прием кверцетина в дозе до 1000 мг в день не приводил ни к каким побочным эффектам, биохимия крови, показатели гомеостаза и электролиты оставались в норме. По выводам исследователей, что кверцетин в дозе до 1000 мг в день хорошо переносится и не вызывает побочных эффектов(21).

Заключение

Предварительные исследования показали, что кверцетин действительно обладает терапевтической активностью при РМЖ, раке яичников и раке эндометрия. Кверцетин имеет перспективы в химиотерапии у пациентов с данными видами рака как безопасный и эффективный агент. Хотя кверцетин в низких дозах обладает цитотоксической активностью, его антипролиферативный эффект обуславливается преимущественно ингибированием клеточного цикла на переходе от фазы G₁ к фазе S ,что приводит к повреждению ДНК опухолевых клеток DNA с последующей активацией киназ, снижением фосфорилирования отдельных протеинов, вовлеченных в синтез мембран опухолевых клеток и в итоге – к прекращению клеточного цикла и апоптозу опухолевых клеток в фазе Chk2(2). Эти данные свидетельствуют о высоком потенциале кверцетина как потенциально эффективного препарата в области онкогинекологии , синергичного с многими агентами, применяемыми в стандартных протоколах химиотерапии онкологических заболеваний женской репродуктивной системы. Все это делает кверцетин перспективным кандидатом для проведения широкомасштабных клинических исследований у пациентов с РМЖ, РЭ и раком яичников.

Список литературы:

1. Gregory S. Kelly ND. Quercetin. AMR 2011; 16:2: 172-94
2. J. Jeong, Jee Young An, Yong Tae Kwon, Juong G. Rhee, Yong J. Lee2Effects of low dose quercetin: Cancer cell-specific inhibition of cell cycle progression. J Cell Biochem. 2009 January 1; 106(1): 73–82.
3. Jain AK, Thanki K, Jain S.Co-encapsulation of Tamoxifen and Quercetin in Polymeric Nanoparticles: Implications on Oral Bioavailability, Antitumor Efficacy, and Drug-Induced Toxicity. Mol Pharm. 2013 Sep 3;10(9):3459-74. doi: 10.1021/mp400311j. Epub 2013 Aug 8
4. Hofmann J, Fiebig HH, Winterhalter BR, et al.Enhancement of the antiproliferative activity of cisdiamminedichloroplatinum(II) by quercetin. Int J Cancer 1990;45:536-539
5. Scambia G, Ranelletti FO, Benedetti Panici P, Piantelli M, Bonanno G, De Vincenzo R, Ferrandina G, Maggiano N, Capelli A, Mancuso S.Inhibitory effect of quercetin on primary ovarian and endometrial cancers and synergistic activity with cis-diamminedichloroplatinum (II). Gynecol Oncol. 1992 Apr;45(1):13-9.
6. Kuhlmann MK, Horsch E, Burkhardt G, Wagner M, Köhler H. Reduction of cisplatin toxicity in cultured renal tubular cells by the bioflavonoid quercetin. Arch Toxicol. 1998 Jul-Aug;72(8):536-40.
7. Hofmann J, Doppler W, Jakob A, et al.Enhancement of the antiproliferative effect of cisdiamminedichloroplatinum(II) and nitrogen mustard by inhibitors of protein kinase C. Int J Cancer 1988;42:382-388.
8. Kaneuchi M, Sasaki M, Tanaka Y, Sakuragi N, Fujimoto S, Dahiya R. Quercetin regulates growth of Ishikawa cells through the suppression of EGF and cyclin D1. Int J Oncol. 2003 Jan;22(1):159-64.
9. Zhou W, Kallifatidis G, Baumann B, et al. Dietary polyphenol quercetin targets pancreatic cancer stem cells. Int J Oncol 2010;37:551-561.
10. Steerenberg PA, Garssen J, Dortant PM, et al. The effect of oral quercetin on UVB-induced tumor growth and local immunosuppression in SKH-1. Cancer Lett 1997;114:187-189.
11. Soule HD, Maloney TM, Wolman SR, Peterson WD, Jr, Brenz R, McGrath CM, Russo J, Pauley RJ, Jones RF, Brooks SC. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Res. 1990;50:6075–86.
12. Ferry DR, Smith A, Malkhandi J, et al. Phase I clinical trial of the flavonoid quercetin: pharmacokinetics and evidence for in vivo tyrosine kinase inhibition. Clin Cancer Res1996;2:659-668.
13. Chen C, Zhou J, Ji C. Quercetin: a potential drug to reverse multidrug resistance. Life Sci 2010;87:333-338.
14. Borska S, Sopel M, Chmielewska M, et al. Quercetin as a potential modulator of P-glycoprotein expression and function in cells of human pancreatic carcinoma line resistant to daunorubi- cin. Molecules 2010;15:857-870.
15. Kim SH, Yeo GS, Lim YS, et al. Suppression of multidrug resistance via inhibition of heat shock factor by quercetin in MDR cells. Exp Mol Med 1998;30:87-92.
16. Oh SJ, Kim O, Lee JS, et al. Inhibition of angiogenesis by quercetin in tamoxifen-resistant breast cancer cells. Food Chem Toxicol 2010;48:3227-3234.
17. Shen J, Zhang W, Wu J, Zhu Y. The synergistic reversal effect of multidrug resistance by quercetin and hyperther- mia in doxorubicin-resistant human myelogenous leukemia cells. Int J Hyperthermia 2008;24:151-159.
18. Sliutz G, Karlseder J, Tempfer C, et al. Drug resistance against gemcitabine and topotecan mediated by constitutive hsp70 overexpression in vitro: implica- tion of quercetin as sensitiser in chemotherapy. Br J Cancer 1996;74:172-177.
19. Thangasamy T, Sittadjody S, Mitchell GC, et al. Quercetin abrogates chemore- sistance in melanoma cells by modulat- ing deltaNp73. BMC Cancer 2010;10:282.
20. Scambia G, Raneletti FO, Panici PB, et al. Synergistic antiproliferative activity of quercetin and cisplatin on ovarian cancer cell growth. Anticancer Drugs 1990;1:45-48
21. Davis W. Lamson, MS, ND, and Matthew S. Brignall, ND. Antioxidants and Cancer III: Quercetin. Altern Med Rev 2000;5(3):196-208
22. Okamoto T. Safety of quercetin for clinical application (Review). Int J Mol Med 2005;16:275-278.
23. Avila MA, Velasco JA, Harter KW, et al. Quercetin as a modulator of the cellular neoplastic phenotype. Adv Expl Med Biol 1996;401:101-110.
24. Nigro JM, Baker SJ, Preisinger AC, et al. Mutations in the p53 gene occur in diverse human tumour types. Nature 1989;342:705-708.
25. Yoshida M, Sakai T, Hosokawa N, et al. The effect of quercetin on cell cycle progression and growth of human gastric cancer cells. FEBS Lett 1990;260:10-13.
26. Ferry DR, Smith A, Malkhandi J, et al. Phase I clinical trial of the flavonoid quercetin:pharmacokinetics and evidence for in vivo tyrosine kinase inhibition. Clin Cancer Res1996;2:659-668.
27. Markaverich BM, Roberts RR, Alejandro MA,et al. Bioflavonoid interaction with rat uterine type II binding sites and growth inhibition. JSteroid Biochem 1988;30:71-78
28. Piantelli M, Maggiano N, Ricci R, et al.Tamoxifen and quercetin interact with type II estrogen binding sites and inhibit the growth ofhuman melanoma cells. J Invest Dermatol1995;105:248-253.