Чувствительность бифидобактерий к противомикробным препаратам

Методы: Пятьдесят штаммов, принадлежащих к восьми разновидностям бифидобактерий были протестированы на чувствительность к 30 антибиотикам диско-диффузионным методом с помощью агара Brucella, дополненного 5% лаковой кровью овец и витамином К1 (1 мг/л). Минимальные подавляющие концентрации (МПК) девяти противоанаэробных агентов, включая три новых вещества (телитромицин, линезолид и гатифлоксацин), были определены с использованием стандартного метода разведений в агаре.

Результаты: Все штаммы бифидобактерий любых разновидностей, были чувствительны к пенициллинам: пенициллин G, амоксициллин (МПК₅₀ 0,06 мг/л), пиперациллин, тикарциллин, имипенем и, обычно, к антибиотикам против грамположительных бактерий (макролиды, клиндамицин, пристинамицин, ванкомицин и тейкопланин). Чувствительность к цефалотину и цефотетану была непостоянной. Большинство культур (70%) были устойчивы к фусидовой кислоте. Как ожидалось, высокая степень сопротивляемости наблюдалась для аминогликозидов. Метронидазол, агент, известный своей противоанаэробной активностью, оказался неэффективен против 38% штаммов. Новые запущенные в серийное производство вещества, телитромицин, линезолид и гатифлоксацин, были активны при МПК₅₀ 1 мг/л. Единственное изменение чувствительности наблюдалось среди различных видов в отношении штамма Bifidobacterium breve, который оказался в целом более стойким. Потенциально приобретенная резистентность наблюдалась только в отношении тетрациклина и миноциклина, у 14% штаммов.

Заключение: Что касается общего вопроса безопасности пробиотков, такого как показатели потенциальной переносимости, бифидобактерий, с их низкой природной и приобретенной резистентностью к 30 антибиотикам, считаются безрисковыми.

Введение

Бифидобактерии — это анаэробные, грамположительные организмы стержнеобразной формы с характерным Y или V-образным окончанием. Они населяют, главным образом, слизистую кишечника и влагалища человеческих организмов и животных¹. Бифидобактерии относятся к группе молочнокислых бактерий (МКБ), которые включают пробиотические штаммы молочнокислых бактерий, бифидобактерий и разновидности энтерококков¹. Они известны как пробиотические организмы, благодаря их потенциально благоприятному действию в кишечном тракте, особенно в плане поддержания микробного баланса, путем ингибирования роста патогенных микроорганизмов². Репутация бифидобактерии в качестве промоутеров здоровья стала причиной их использования во вспомогательном бактериальном питании и в профилактике и терапии желудочно-кишечных инфекций и диареи, вызванной лечением антибиотиками^3,5.

Определение чувствительности к противомикробным препаратам бактериального штамма — это важная предпосылка для его утверждения в качестве пробиотика. Некоторые авторы заявляют, что в случаях одновременного назначения с антибиотиками для предупреждения и лечения кишечных расстройств, пробиотики должны быть устойчивы к определенным антибиотикам для того, чтобы выжить в желудочно-кишечном тракте⁶. Однако, это мнение является спорным. Пробиотики, имеющие черты резистентности, могут оказывать неблагоприятное воздействие на здоровье человека. Риски, связанные с потенциальным переносом резистентности к антибиотикам от пробиотических штаммов к патогенным микроорганизмам желудочно-кишечного тракта, представляют собой серьезную проблему, особенно после сообщения о пробиотике, Enterococcus faecium, который, как было установлено, является возможным реципиентом устойчивого к гликопептидам гена vanA.⁷

Сообщалось о наличии устойчивых к антибиотикам генов у многих МКБ, и о передаче плазмидов и конъюгативных транспозонов в и из МБК, в разновидностях Enterococcus и Lactobacillus. Насколько нам известно, конъюгативные плазмиды не были описаны в бифидобактериях¹. Однако, штаммы бифидобактерий могут быть патогенными и вызывать желудочно-кишечные и внекишечные инфекции, хотя эти инфекции описываются довольно редко. Патогенные штаммы бифидобактерий были выделены из болезнетворных микроорганизмов, обнаруженных в абдоминальной области, в абсцессах, акушерской/гинекологической областях и в грудной клетке8.  Bifidobacterium dentium и Bifidobacterium adolescentis отвечали за половину таких инфекций и были также вовлечены, как описано в другом исследовании, в бактериемию⁹.

Чувствительность бифидобактерий к противомикробным препаратам не подвергалась серьезным сомнениям до настоящего времени, и те немногочисленные данные, которые имеются в литературе, являются неоднородными и противоречивыми. Данное исследование было проведено для точного определения чувствительности штаммов вида Bifidobacterium, выделенных из различных источников, к нескольким группам обычных противомикробных веществ.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы

Изучили пятьдесят штаммов бифидобактерий, включая семь эталонных штаммов, полученных из Коллекции Института Пастера (Париж, Франция). Эти штаммы, представляющие различные виды бифидобактерий, были выделены из различных сред, 15 штаммов ― из фекалий взрослых людей, 26 ― из фекалий новорожденных или младенцев, пять ― из пробиотических продуктов, два― из кишечника младенцев, один ― из фекалий животного и один — из кариозной полости человека. Число протестированных штаммов подразделялось следующим образом: Bifidobacterium longum, 14; Bifidobacterium pseudocatenulatum, 11; Bifidobacterium bifidum, 8; Bifidobacterium animalis/Bifidobacterium lactis, 8; Bifidobacterium breve, 6; B. adolescentis, 1; Bifidobacterium angulatum, 1; B. dentium, 1. Clostridium perfringens ATCC 13124T, Bacteroides fragilis ATCC 25285 и Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741, полученные из Американской коллекции типовых культур (Роквилл, Мэриленд, США), использовались в качестве контрольных штаммов, как было предложено Национальным Комитетом по клиническим лабораторным стандартам.

Среда

Бульон, содержащий триптон пептон (30 г/л), глюкозу (5 г/л), дрожжевой экстракт (20 г/л) и гемин (5 мг/л), использовался для культивирования штаммов в жидкой среде (TGYH). Агар Brucella (BBL, Becton Dickinson, Ле Пон де Кле, Франция), дополненный 5% лаковой кровью овец и витамином K1 (1 мг/л), применялся для культивирования штаммов на твердой среде и для тестов на чувствительность к противомикробным препаратам.

Все опыты проводились в анаэробной камере (Don Whitley, AES Laboratoire, Комбур, Франция), промытой не содержащей O2 газовой смесью (CO₂/H₂/N₂, 10/10/80).

Тесты на чувствительность к противомикробным препаратам

В первой части исследования, тест на чувствительность штаммов бифидобактерий к противомикробным препаратам выполнялся дискодиффузионным методом, согласно рекомендациям CA-SFM (Комитета по антибиотикам французского общества микробиологов)¹⁰. Исходные культуры содержались при температуре 80°С в криопробирках в бульоне с сердечно-мозговым экстрактом, содержащим глицерин (15% об/об), и анаэробно переводились на агар Brucella при 37,8°С за 48 часов до исследования. Затем подготавливался посевной материал для каждого тест-микроорганизма путем создания взвеси клеток в бульоне TGYH для достижения мутности, эквивалентной 1,0 стандарта Мак Фарланда (3х108 клеток/мл), который помещался в чашку с агаровой средой. Стандартные диски с 32 противомикробными препаратами размещались на поверхность чашек. Диаметры зоны подавления измерялись после анаэробной инкубации при 37,8°C в течение 48 часов. Диски с антибиотиками были получены от Bio-Rad, Марн ля Кокет, Франция, кроме метронидазола (Neo-Sensitabs, Роско, Дания) и телитромицина (Oxoid, Дардилли, Франция).

Во второй части исследования МПК девяти антибиотиков (пенициллина G, амоксициллина, цефокситина, тетрациклина, эритромицина, телитромицина, линезолида, ванкомицина и гатифлоксацина) определялись с использованием эталонного метода растворения в агаре, рекомендованного CA-SFM и NCCLS (Национальный Комитет по клиническим и лабораторным стандартам)^10,11.

Пенициллин G, амоксициллин, цефокситин, ванкомицин, тетрациклин и эритромицин были выбраны для проверки наиболее часто встречающихся механизмов приобретенной резистенции для грамположительных анаэробов.

Телитромицин, линезолид и гатифлоксацин были выбраны потому, что они являются новыми антибиотиками.

Телитромицин, гатифлоксацин и линезолид были предоставлены как стандартизированные порошки, соответственно, Aventis Pharmaceuticals (Роменвиль, Франция), Grunenthal (Париж, Франция) и Pharmacia-Upjohn (Гиянкур, Франция).

Порошки известной эффективности пенициллин G, амоксициллин, цефокситин, тетрациклин, эритромицин и ванкомицин были получены из коммерческих источников.

Растворы 512 мг/л каждого антибиотика были приготовлены в соответствующих растворителях, плюс двойное разбавление в дистиллированной воде до смешивания с агаром Brucella, дополненным лаковой кровью овец и витамином K1. Все чашки были использованы в течение 24 часов после приготовления. Посевной материал был подготовлен для каждого тест-микроорганизма путем создания взвеси клеток в бульоне TGYH для достижения мутности, эквивалентной 1,0 стандарта Мак Фарланда (3х108 клеток/мл) и был помещен репликаторным способом Стира в чашки с агаровой средой. В начале каждой серии тестов, чашка без противомикробных средств была засеяна для определения жизнестойкости организмов и для использования в качестве контроля сравнения роста. Чашки были выдержаны в анаэробной камере при 37,8°С в течение 48 часов. Поскольку для анаэробов может быть затруднено определение конечных показателей, МПК определялась как самая низкая концентрация противомикробного средства, которая привела к отсутствию роста или к появлению лишь небольшого числа колоний, или к значительному снижению роста, как рекомендовано NCCLS¹². Степени резистентности рассчитывались в соответствии с французскими пограничными значениями (мг/л), которые, в большинстве своем, идентичны пограничным значениям NCCLS и соответствуют следующим показателям: пенициллин G (>16), амоксициллин (>16), цефокситин (>32), тетрациклин (>8), эритромицин (>4), телитромицин (>2), линезолид (>4), ванкомицин (>16) и гатифлоксацин (>2). Каждый опыт повторялся три раза в двух экземплярах и включал контрольные штаммы.

Исследования активности β-лактамазы с помощью нитроцефиновых тестов

Диски хромогенного цефалоспорина, нитроцефина (bioMe'rieux, Марси-л'Этуаль, Франция) использовались для определения активности β-лактамазы¹³. B. fragilis ATCC 25285 использовался для положительного контроля.

Испытания для определения детерминант резистентности к тетрациклину методом ПЦР

Тотальная геномная ДНК была извлечена из всех резистентных к тетрациклину штаммов и использована для амплификации с вырожденными праймерами, которые идентифицируют все известные гены Tcr для защиты рибосомы. Также были выполнены амплификации с праймерами, характерные для генов tet(M) и tet(W). Условия ПЦР и наборы праймеров соответствовали описанным Barbosa и др.,¹⁴ Roberts и др.¹⁵ и Scott и др.¹⁶ E. faecium UW7 использовался в качестве положительного контроля для ПЦР tet(M) и вырожденного tet, a Butyrivibrio fibrisolvens 1.230 использовался в качестве положительного контроля для ПЦР tet(W)^14-17.

Результаты

Результаты тестов дискодиффузионным методом на чувствительность к противомикробным средствам на 50 штаммах бифидобактерий приведены в таблице 1, и МПК девяти противомикробных средств, включая новые вещества, запущенные в серийное производство, телитромицин, линезолид и гатифлоксацин, показаны в таблице 2.

Таблица 1. Чувствительность бифидобактерий к противомикробным средствам с использованием дискодиффузионного метода

Ни один из штаммов бифидобактерий, независимо от вида, не был резистентным к пенициллину G, амоксициллину, амоксициллину/клавулановой кислоте, тикарциллину, пиперациллину, цефотаксиму и имипенему в протестированных концентрациях антибиотиков. Устойчивость к цефотетану наблюдалась у 26% штаммов. Только один штамм B. longumи один штамм B. breve были резистентны к цефокситину, при МПК 64 мг/л. Имипенем и цефотаксим создали обширные зоны подавления на тестируемых микроорганизмах, означающие низкие МПК. Выработка β-лактамазы штаммами бифидобактерий не была выявлена.

Все штаммы были обычно чувствительны к антибиотикам, действующим на грамположительные бактерии. Эритромицин и телитромицин были высокоактивны при МПК₅₀, соответственно, < 0.06 и < 0.0015 мг/л. Ни один из штаммов бифидобактерий не был устойчив к клиндамицину или пристинамицину. МПК₅₀ для ванкомицина и линезолида была < 1 мг/л.

Высокая степень резистентности наблюдалась для метронидазола и аминогликозидов при использовании дискодиффузионного метода. В испытываемой концентрации метронидазол был неэффективен в отношении 38% тест-микроорганизмов. Малые дозы канамицина (30 мкг) и гентамицина (15 мкг) совсем не действовали, 100% штаммов оказались резистентными. Однако исследуемые штаммы были чувствительны к высоким дозам канамицина (1000 мкг) или гентамицина (500 мкг).

Все штаммы были резистентны к налидиксовой кислоте. Офлоксацин выявил различные размеры зон подавления, при этом резистентность отмечалась для штаммов каждого вида. Ни один из штаммов бифидобактерий не был устойчив к гатифлоксацину, представителю нового поколения фторхинолонов с антианаэробными свойствами (МПК₅₀ = 1мг/л).

Фусидовая кислота в испытываемой концентрации была неэффективной, только 30% штаммов оказались чувствительны. Рифампицин был относительно активен и подавлял 96% штаммов бифидобактерий.

Противобактериальные средства широкого спектра действия, хлорамфеникол и тетрациклин, действовали по-разному. Ни один из штаммов не был устойчив к хлорамфениколу, в то время как тетрациклин и миноциклин показали различные модели действия в отношении испытываемых штаммов. Три штамма B. pseudocatenulatum, два штамма B. longum и два штамма B. bifidum оказались устойчивы к тетрациклину, с МПК 16 или 64 мг/л. Устойчивость к тетрациклину была во всех случаях связана с устойчивостью к миноциклину. Остальные штаммы были чувствительны к данной группе антибиотиков. ПЦР, выполненные на семи резистентных к тетрациклину штаммах, выявили положительные амплификации с вырожденными праймерами для B. bifidum R2, B. longum B36 и B. pseudocatenulatum R47. Ген Tet(W) был обнаружен в тех же штаммах B. bifidum и B. pseudocatenulatum, которые показали положительные результаты для ПЦР с использованием вырожденных праймеров. Ген tet(M) не был обнаружен у резистентных к тетрациклину бифидобактерий, протестированных в ходе данного исследования.

Ген Tet(W) у бифидобактерий

Согласно полученным результатам, профиль чувствительности не является определенным для конкретных видов, и наблюдаются существенные различия между штаммами. Однако, виды B. breve оказались в целом более устойчивыми к антибиотикам.

Обсуждение

Чувствительность бифидобактерий к антибиотикам является важным вопросом не только в тех немногих случаях, когда микроорганизмы являются патогенными и вызывают инфекции, но также при понимании изменений нормальной флоры кишечника, когда назначаются антибиотики, и при выборе штамма бифидобактерий в качестве пробиотика. Необходимо отметить, что исследование чувствительности к противомикробным препаратам для данного типа анаэробных и медленно растущих бактерий является непростым, и иногда требует повторного проведения опытов.

β-лактамы, гликопептиды и эритромицин были высоко активны в отношении испытываемых бифидобактерий. Новые классы антибиотиков, т.е. кетолиды и оксазолидиноны, а также новые вещества, обладающие антианаэробными свойствами, т.е. гатифлоксацин, были очень эффективны. Цефалотин и цефотетан были менее активны, чем другие β-лактамы. Устойчивость к противомикробным препаратам группы β-лактамов может проявляться через целый ряд механизмов, включая выработку β-лактамаз (пенициллиназы или цефалоспориназы), гидролизирующих действие антибиотика¹⁸. Такой механизм устойчивости не наблюдался в ходе данного исследования, что свидетельствует об альтернативных механизмах устойчивости к β-лактамам, таких как непроницаемость клеточной стенки или изменение пенициллинсвязывающего белка¹⁸. Все протестированные штаммы бифидобактерий были в действительности устойчивы к аминогликозидам низкой активности вследствие отсутствия транспорта лекарственных препаратов посредством системы цитохромов между анаэробами¹⁹. Никакой приобретенной резистентности к аминогликозидам не наблюдалось в отношении исследуемых штаммов. Наши результаты согласуются с предыдущими исследованиями^20,23. Charteris и др.²⁴ наблюдали высокую степень резистентности к гликопептидам и цефокситину. Это отличается от наших наблюдений, а также от результатов, полученных Citron и др.²⁵, когда ванкомицин (МПК₅₀= 0.5 мг/л в ходе обоих исследований) и цефокситин (МПК₅₀ = 4 мг/л и МПК₅₀ = 2 мг/л, соответственно) были однозначно определены как высокоактивные препараты в отношении штаммов бифидобактерий. Это противоречие можно пояснить ограниченной надежностью дискодиффузионного метода для определения резистентности к ванкомицину, по сравнению с методом разведений в агаре. Также это можно пояснить питательной средой для культур, поскольку Charteris и др.²⁴ использовали среду триптиказа, пептон, дрожжевой экстракт (TPY) вместо агара Brucella, дополненного лаковой кровью и витамином K1.

Чувствительность бифидобактерий к различным антибиотикам важна для лечения редких случаев, в которых бифидобактерии являются патогенными агентами⁸. Противомикробные препараты, используемые в определенных клинических условиях для лечения анаэробных или смешанных инфекций, такие как амоксициллин (отдельно или вместе с клавулановой кислотой), имипенем, клиндамицин и цефокситин являются высоко активными в отношении бифидобактерий. Назначение одного из этих компонентов может привести к устранению таких бактерий с инфицированного участка. Тогда как устойчивость к клиндамицину проявилась для 11% не образующих споры грамположительных анаэробных бацилл, согласно исследованиям Могу и др.²⁶ все штаммы бифидобактерий были ингибированы клиндамицином в ходе данного исследования.

Относительная устойчивость бифидобактерий к метронидазолу хорошо освещается в данном исследовании. Активность метронидазола поясняется преимущественным уменьшением системой бактериальных ферредоксинов исходного соединения, генерирующего промежуточный продукт, ответственный за разрывы двухспиральной ДНК²⁷. У некоторых штаммов бифидобактерий отсутствует система ферредоксинов, отвечающая за уменьшение исходного соединения, что дает в результате высокую резистентность к метронидазолу, препарату, обладающему высокой активностью в отношении фактически всех облигатных анаэробов.

Наше исследование не выявило штаммов анаэробных микроорганизмов, устойчивых к линезолиду, также такие штаммы не были выявлены в ходе исследования Behra Miellet и др.²⁸, которое оценило указанный антибиотик как многообещающего кандидата для лечения инфекционных заболеваний, вызываемых анаэробными микроорганизмами. В данном исследовании наиболее активным агентом оказался телитромицин, который выявил самые низкие показатели МПК против всех протестированных штаммов бифидо