Чувствительность Helicobacter pylori к cиметикону и другим неантибактериальным препаратам

Отмечалось выборочное угнетение Helicobacter pylori при применении симетикона в дозе 64-128 мг/л, габексата мезилата в дозе 64-128 мг/л. Кетоконазол, диметилсульфоксид и аллопуринол в дозе 16-64 мг/л не оказывали антибактериального эффекта в терапевтических концентрациях. В связи с этим, габексата мезилат, кетоконазол и, в частности, симетикон являются лекарственными средствами, рекомендованными при лечении инфекции Helicobacter pylori.

Helicobacter pylori является возбудителем хронического гастрита и пептической язвенной болезни (Buck; Lee, Fox и Hazell, NIH). Инфицирование Helicobacter pylori может ассоциироваться с некоторыми формами неязвенной диспепсии, и вероятно связано с возникновением аденокарциномы желудка (Parsonett и соавторы), лимфомы MALT (Wotherspoon и соавторы) и неходжкинской лимфомы (Parsonett и соавторы). Инфекция Helicobacter pylori распространена во всем мире. В промышленно развитых странах распространенность этой инфекции составляет около 0,5%-1,0% в год; инфицированы приблизительно 50% лиц в возрасте до 60 лет (Blaser). В промышленно неразвитых странах распространенность инфекции Helicobacter pylori существенно выше, обнаруживается частое инфицирование даже детей (Talley и Noack). Таким образом, вероятно, что половина населения мира инфицирована Helicobacter pylori (Blaser).

Эффективных методов профилактики не существует, в частности, в связи с тем, что путь передачи возбудителя от человека к человеку неизвестен (Mitchell); а также, в связи с отсутствием вакцины в настоящее время и в ближайшем будущем (Goodwin). Более того, отмечаются трудности достижения эрадикации Helicobacter pylori. Для достижения частоты эрадикации на уровне 80%-90% необходимо применять тройную схему, например, висмута субсалицилат, тетрациклин, и метронидазол (NIH), или ранитидин, амоксициллин, и метронидазол (Hentschel и соавторы), или двойную схему, включающую омепразол плюс амоксициллин (Bayerdorffer и соавторы). Эти схемы лечения вызывают существенные побочные эффекты, в частности резистентность к антимикробным средствам (NIH). Кроме того, эти схемы лечения дорогостоящие. Рекомендуется ограничение назначения антимикробного лечения, направленного на эрадикацию Helicobacter pylori, только у пациентов с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки и желудка с наличием симптомов (NIH).

Однако, общеизвестно, что инфекция Helicobacter pylori вызывает ряд изменений слизистой оболочки желудка, что, в конечном счете, приводит к кишечной метаплазии, дисплазии и раку желудка (Telfold и соавторы). В связи с этим, показания к лечению расширяются и включают пациентов с неязвенной диспепсией и лиц, у которых не выявлены симптомы заболевания (О'Morain). Классические антибиотики не применимы для широкого использования. Для расширения показаний к лечению носителей инфекции Helicobacter pylori могут применяться лекарственные средства или их комбинации со следующими свойствами:

• антибактериальные средства, не оказывающие влияния на экологию;
• средства, нетоксичные даже в высоких дозах, и применимые для детей младшего возраста;
• по возможности недорогие препараты, в связи с чем их применение не будет ограничиваться состоятельными людьми или индустриально-развитыми странами.

Для того чтобы разработать альтернативные схемы эрадикации Helicobacter pylori, были выбраны лекарственные средства, не принадлежащие к классу антибактериальных средств, но применяемые при желудочно-кишечных заболеваниях, по крайней мере, экспериментально. Такими препаратами были следующие:

• ветрогонный препарат симетикон, применяемый для лечения метеоризма (Auteri);
• ингибитор протезы габексата мезилат, применяемый для лечения острого панкреатита (Yang, Chang-Chien & Liaw, Biichler и соавторы);
• противогрибковый препарат кетоконазол, используемый для уменьшения колонизации кишечника дрожжевыми грибками (Kucers & Bennett; von Recklinghausen, Di Maio & Ansorg);
• гидроксилдиметилсульфоксид (DMSO) и аллопуринол, применяемые для профилактики рецидива язвы двенадцатиперстной кишки (Salim).

В данном исследовании изучалась чувствительность Helicobacter pylori к указанным лекарственным средствам.

Материалы и методы

Лекарственные средства, штаммы и условия культивирования

Применялся симетикон в виде суспензии, содержащей диметикон 3000-кремния диоксид, 97:3. Габексата мезилат (FOYTm) был приобретен в компании Ono Pharmaceutical Co., Осака, Япония. Кетоконазол был предоставлен компанией Jansenn AG, Neuss, Германия. Диметилсульфоксид и аллопуринол были предоставлены компанией Sigma Chemical Co., США.

11 клинических штаммов Helicobacter pylori (IMMI) были выделены из биопсийного материала антрального отдела желудка. В качестве эталонного штамма использовался Helicobacter pylori ATCC 43504. Для сравнения и контроля были применены Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Bacteroides thetaiotaomicron ATCC29148, Clostridium perfringens ATCC 13124.

Штаммы культивировались на кровяном агаре овцы, состоящем из основы из кровяного агара (СМ 55, Oxoid, Basingstoke, Великобритания) и 5% крови овцы (FSR 1055, Oxoid). Штаммы Helicobacter pylori культивировались при температуре 37°С в течение 5-ти дней при микроаэрофильных условиях (Anaerocult C.E. Merck, Darmstadt, Германия); S1.aureus, E.coli, P.aeruginosa культивировались при аэробных условиях при температуре 37°С в течение 24 часов. B.thetaiotaomicron и C.perfringens культивировались при анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 48 часов. Культуры получали путем промывания физиологическим раствором. Суспензии инокулята были скорректированы относительно мутности по стандарту мутности МакФарланда номер 2.

Чувствительность Helicobacter pyloriк неантибактериальным средствам

Оценка диффузии в агаре

Были приготовлены чашки Петри для проведения испытания с глубиной агара 4 мм путем наливания CD агара, состоящего из основы из кровяного агара (СМ 55, Oxoid). В чашки Петри с агаром были посеяны суспензии инокулята 0,1 мл. Ячейки округлой формы диаметром 4 мм были отделены от засеянного агара с помощью металлического цилиндра и небольшого отрицательного давления. Ячейки с агаром были заполнены 25 мкл последовательными разведениями тестируемых лекарственных средств. После инкубации при аналогичных условиях культивирования, как и для подготовки инокулята, производилось считывание зон угнетения роста.

Оценка разведения в микроагаре

Были приготовлены последовательные разведения лекарственных средств в панели микротитратора с плоскодонными ячейками (Nunc, Wiesbaden, Германия). Разведения были смешены с растаявшим CD агаром (180 мкВ) при температуре 60°С. После затвердевания чашки Петри культивировались при температуре 37°С в течение 2 часов с целью высушивания поверхности агара. Инкубация инокулированных планшетов производилась при аналогичных условиях культивирования, как и для подготовки инокулята. Минимальная ингибирующая концентрация (MIC) была записана путем чтения наименьшей концентрации препарата, которая подавляла видимый рост. Контроль роста производился на агаре, содержащем физиологический раствор, и 0,5% уксусной кислоте, соответственно, вместо растворения лекарственных средств.

Тест комбинации

Применяли методику оценки разведения в микроагаре. Были приготовлены последовательные разведения первого препарата в физиологическом растворе, содержащем второй препарат. После добавления агара конечные концентрации первого препарата были аналогичными таковым, применяемым для определений минимальных ингибирующих концентраций, и конечная концентрация второго препарата составила 1/4 его минимальной ингибирующей концентрации тестируемого штамма.

Результаты

В тесте диффузии агара, примененном для скрининга антибактериального эффекта, тестируемые штаммы Helicobacter pylori АТСС 43504 и Helicobacter pylori IMMI 676/89 продемонстрировали зоны ингибирования при концентрации симетикона 2,6 мг/мл, габексата мезилата 2,6 мг/мл и кетоконазола 0,2 мг/мл. DMSO 10% (v/v) и аллопуринол 10 мг/мл не показали зон угнетения.

Лекарственные препараты, оказавшие антибактериальное действие, изучались далее с помощью теста разведения в микроагаре (таблица 1).

Таблица 1. Минимальные ингибирующие концентрации симетикона, габексата мезилата и кетоконазола в отношении Helicobacter pylori и контрольных штаммов

Минимальная концентрация симетикона, ингибирующая рост Helicobacter pylori, составила 64 мг/мл в трех штаммах, и 128 мг/мл в 9 штаммах. Контрольные штаммы S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, В. thetaiotaomicron и С. perfrin-gens не ингибировались при концентрации до 4120 мг/л. Габексата мезилат оказывал минимальные ингибирующие рост 12 штаммов Helicobacter pylori концентрации в диапазоне 64-128 мг/л. Из контрольных штаммов, отмечалось угнетение роста S. aureus при минимальной ингибирующей концентрации 256 мг/л. Минимальные ингибирующие концентрации для других штаммов были 1024 мг/л и выше. Кетоконазол подавлял штаммы Helicobacter pylori при диапазоне минимальной ингибирующей концентрации 16-64 мг/мл; минимальные ингибирующие концентрации для контрольных микроорганизмов превышали 1024 мг/л.

Изучалось влияние комбинаций симетикона, габексата мезилата и кетоконазола на Helicobacter pylori АТСС 43504 и Helicobacter pylori IMMI 676/89 путем определения минимальной ингибирующей концентрации одного препарат в присутствии фиксированной субингибирующей концентрации второго препарата (табл. 2).

Таблица 2. Влияние комбинаций симетикона, габексата мезилата и кетоконазола на Helicobacter pylori

О синергическом влиянии второго препарата можно предположить при уменьшении минимальной ингибирующей концентрации первого препарата, по крайней мере, в 4 раза по сравнению с минимальной ингибирующей концентрацией, определенной при отсутствии второго препарата. Минимальная ингибирующая концентрация симетикона существенно не изменялась в присутствии габексата мезилата или кетоконазола и наоборот. Комбинация габексата мезилата и кетоконазола оказывала разный эффект на два тестируемых штамма. В отношении Helicobacter pylori АТСС 43504 минимальные ингибирующие концентрации габексата мезилата и кетоконазола не изменялись при добавлении второго препарата. В отношении Helicobacter pylori IMMI 676/89, однако, добавление кетоконазола сопровождалось уменьшением минимальной ингибирующей концентрации со 128 до 32 мг/мл. Однако добавление габексата мезилата к кетоконазолу не оказало значимого эффекта на минимальную ингибирующую концентрацию кетоконазола. Антагонистическое взаимодействие симетикона, габексата мезилата и кетоконазола не наблюдалось в тестах комбинации.

Обсуждение

В плацебо-контролируемом исследовании было показано, что применение DMSO и аллопуринола существенно уменьшает рецидив язвы двенадцатиперстной кишки (Salim). Пациенты получали 5 мл 10% DMSO или 5 мл 1% аллопуринола каждые 6 часов в течение одного года. Было предположено, что профилактическое действие обеих препаратов основывается на их способности устранять производные кислорода свободные радикалы (Salim). Влияние на Helicobacter pylori, который считается основным патогенетическим фактором возникновения пептической язвы, не изучалось. Данные результаты демонстрируют, что терапевтически применяемые концентрации DMSO и аллопуринола не оказывают ингибирующего влияния на рост Helicobacter pylori in vitro. Таким образом, эти препараты не являются применимыми в качестве лечения, направленного на эрадикацию Helicobacter pylori. Однако не исключено, что оба препарата могут препятствовать факторам адгезии Helicobacter pylori, и таким образом предотвращать повторную колонизацию эпителия желудка и двенадцатиперстной кишки и противостоять рецидиву язвы двенадцатиперстной кишки.

Ингибитор протезы габексата мезилат (MG 417.48), который также уменьшает трипсиновую активацию панкреатической фосфолипазы А2 (Hess, Lankish & Kunze), используется в лечении острого панкреатита. Дозы от 900 мг до 4000 мг применялись внутривенно (Yang и соавторы; Buchler и соавторы). Поскольку период полувыведения габексата мезилата составляет менее 1 минуты, концентрация в крови согласно расчетам составляет менее 106 моль/л (Wittenberg & Magerstedt) соответственно 0,417 мг/л. Helicobacter pylori продуцирует протеолитические и липолитические ферменты (Ottlecz и соавторы). Угнетение роста, вызванное габексата мезилатом, продемонстрированное в экспериментах, вероятно, основывается на подавлении бактериальных ферментов. Однако, минимальные ингибирующие концентрации в диапазоне от 32 мг/л до 128 мг/л намного выше таковых уровня препарата в крови. Маловероятно, что концентрации, подавляющие Helicobacter pylori, достигаются в желудке и двенадцатиперстной кишке после внутривенного введения препарата. Локальные концентрациии, превышающие минимальные ингибирующие концентрации, могут быть получены при пероральном применении габексата мезилата, однако фармакологические и токсикологические характеристики препарата после приема внутрь неизвестны. Эти данные должны быть известны до того, как габексата мезилат станет рассматриваться в качестве препарата для лечения инфекции Helicobacter pylori.

Активность кетоконазола в отношении Helicobacter pylori была продемонстрирована в предшествующих исследованиях, в которых была показана чувствительность Helicobacter pylori к противогрибковым средствам группы нитроимидазола (Rautelin и соавторы, 1992; von Recklinghausen, Di Maio & Ansorg). Кетоконазол назначается внутрь в рекомендованной дозе для взрослых 200 мг (одна таблетка) в день (Kucers & Bennett). Преобразование соединения в активную и абсорбируемую соль гидрохлорида происходит в желудке (Kucers & Bennett), вследствие достижения локальных концентраций, превышающих минимальные ингибирующие концентрации от 16 до 64 мг/л для Helicobacter pylori. Фармакологические и токсикологические данные препарата хорошо известны.

Таким образом, клинические исследования, направленные на подтверждение значения кетоконазола в элиминации Helicobacter pylori из желудка являются обоснованными. Антибактериальный спектр кетоконазола очевидно ограничен Helicobacter pylori, и возможно стафилококком (Heeres и соавторы). В отличие от антибиотиков, используемых в современных схемах эрадикации Helicobacter pylori, кетоконазол обладает веским преимуществом отсутствия влияния на нормальную бактериальную флору и не приводит к формированию резистентности бактерий. С другой стороны, вероятность развития побочных эффектов (Kucers & Bennett) ограничивает показания к лечению применением у пациентов с симптоматической инфекцией Helicobacter pylori.

В течение 40 лет симетикон применяется для симптоматического лечения метеоризма, и в качестве премедикации перед рентгенологическим, эндоскопическим и сонографическим исследованием желудочно-кишечного тракта (Auteri). Соединение действует как ветрогонное средство, увеличивая поверхностное натяжение жидкостей, таким образом, разрушая большие газовые пузыри в пену. Дозы 40-250 мг назначаются 3-4 раза в день (Niedner), и могут быть увеличены благодаря химической инертности, не всасыванию, не токсичности и отсутствию побочных эффектов (Heldwein и соавторы; Wabnitz, R.W.). Концентрации, которые можно достигнуть в желудке, превышают таковые минимальных ингибирующих концентраций 64-128 мг/л для Helicobacter pylori.

Таким образом, препарат может рассматриваться в качестве альтернативы более агрессивным двойной и тройной схемам лечения, направленного на эрадикацию Helicobacter pylori и должен изучаться в клинических исследованиях. Согласно недавним исследованиям, симетикон оказывает терапевтический эффект при лечении язвы желудка, сравнимый таковому ингибитору Н2-гистаминовых рецепторов ранитидину (Groitl, Schmidt & Upmeyer). Элиминация Helicobacter pylori достигалась более эффективно у пациентов в группе лечения симетиконом, чем в группе ранитидина. Эти клинические результаты и настоящие микробиологические данные впервые демонстрируют эффект силоксанов относительно Helicobacter pylori, побуждая к более расширенным исследованиям этого класса лекарственных средств. Существует реальная возможность, что будет найдена схема для эрадикации Helicobacter pylori, которая не ограничивается пациентами с язвой желудка и двенадцатиперстной кишки, а также включает лечение не язвенной диспепсии и бессимптомной инфекции Helicobacter pylori.

В заключение, была обнаружена чувствительность Helicobacter pylori к симетикону, габексату мезилата и кетоко-назолу в диапазонах концентраций, которые достигаются в желудке при терапевтическом применении препаратов. Резистентность представителей других бактериальных видов свидетельствует об особом взаимодействии препаратов с Helicobacter pylori, и дает возможность применения селективной терапии без побочных эффектов. Принимая во внимание фармакологические данные, симетикон является наиболее перспективным средством при лечении всех форм инфекции Helicobacter pylori.

R. Ansorg, G. von Recklinghausen and Ј. Heintschel von Heinegg
Institute of Medical Microbiology University Hospital, Queen's Medical Centre, Nottingham

Литература

1. Auteri A. (1999). Simethicone. In Drugs in Gastroenterology (Brage, P. C, Guslandi, M. & Tittobello, A., Eds), pp. 43346. Raven Press, New York. Bayerdorffer, E., Mannes, G. A., Sommer, A., Hochter, W., Weingart, J., Hatz, R. et al. (1999). High dose omeprazole treatment com bined with amoxycillin eradicates Helicobacter pylori. European Journal of Gastroenterology and Hepatology 4, 697-702.
2. Blascr M. J. (2002). Helicobacter pylori: its role in disease. Clinical Infectious Diseases 15, 386-93.
3. Buchler M., Malfertheiner P., Uhl W., Scholmerich J., Stockmann F., Adle, G. et al. (1993).Gabexate mesilate in human acute pancre atitis. Gastroenterology 104, 1165-70.
4. Buck, G.E. (2000). Campylobacter pylori and gastroduodenal disease. Clinical Microbiological Reviews 3, 1-12.
5. Freise J., Wittenberg H. &Magerstedt P. (1999). In vitro inhibition of phospholipase A2 by gabexate mesilate, camostate, and aprotinine. Klinische Wochenschrift 67, 149-52.
6. Goodwin C.S. (1999). Overview of Helicobacter pylori gastritis, peptic ulcer, and gastric cancer and the possible development of an H. pylori vaccine. In Helicobacter pylori: Biology and Clinical Practice (Goodwin, C. S. & Worsley, B. W., Eds), pp. 431-44. CRC Press
7. Boca Raton. Groitl H., Schmidt A. & Upmeyer, H.-J. (2002). Treatment of gastric ulcers using a specific formulation of polydimethylsilox ane/(UCD). World Congress of Gastroenterology, Abstracts II: Poster presentations. Los Angeles.
8. Heeres J., Backx L.J., Mostmans J. H. & Van Cutsem, J. (1999). Antimycotic imidazoles. Part 4. Synthesis and antifungal activity of ketoconazole, a new potent orally active broad-spectrum antifungal agent. Journal of Medical Chemotherapy 22, 1003-5.
9. Heldwein W, Sommerlatte Т., Hasford J., Lehnert P., Littig G. & Miiller-Lissner, S. (2000). Evaluation of the usefulness of dimethicone and/or senna extract in improving the visualization of abdominal organs. Journal of Clinical Ultrasound 15, 455-8.
10. Hentschel, E., Brandstatter, G., Dragosics, B., Hirschl, A. M., Nemec, H., Schiitze, K. et al. (1993). Effect of ranitidine and amoxicillin plus metronidazole in the eradication of Helicobacter pylori and the recurrence of duodenal ulcer. New England Journal of Medicine 328, 308_12.
11. Hesse, B., Lankisch, P. G. & Kunze, H. (1984). Effects of the serine protease inhibitor gabexate mesilate on purified pancreatic phospholi pase A2. Pharmacological Research Communications 16, 637, 5.
12. Kucers, A. & Bennett, N. McK. (1987). The Use of Antibiotics, pp. 1506_27
13. W. Heinemann, London. Lee, A., Fox, J. & Hazell, S. (1999). Pathogenicity of Helicobacter pylori: a perspective. Infection and Immunity 61, 1601_10.
14. Mitchell, H. M. (2003). The epidemiology of Helicobacter pylori infection and its relation to gastric cancer. In Helicobacter pylori: Biology and Clinical Practice (Goodwin, C. S. & Worsley, B. W., Eds), pp. 95_114. CRC Press,
15. Boca Raton. National Institute of Health (NIH) Consensus Development Conference. (12004). Helicobacter pylori in peptic ulcer disease. Journal of the American Medical Association 272, 65_9.
16. Niedner, N. (1982). Dimethylpolysiloxan bei der Meteorismustherapie_Doppelblinduntersuchung zur Dosis_Wirkungs_Beziehung. Therapiewoche 32, 5390_4.
17. O'Morain, C. & Buckley, M. (1994). Helicobacter pylori associated gastroduodenal diseases. Antiinfective Drugs and Chemotherapy 12, 9_11.
18. Ottlecz, A., Romero, J. J., Hazell, S. L., Graham, D. Y. & Lichtenberger, L. M. (1999). Phospholipase activity of Helicobacter pylori and its inhibition by bismuth salts. Digestive Diseases and Sciences 38, 2071_80.
19. Parsonnet, J., Friedman, G. D., Vandersteen, D. P., Chang, Y., Voeglman, J. H., Orentreich, N. et al. (1991). Helicobacter pylori infection and risk of gastric carcinoma. New England Journal of Medicine 326, 1127_31.
20. Parsonnet, J., Hansen, S., Rodriguez, L., Gelb, A. B., Warnke, R. A., Jellum, E. et al. (2001). Helicobacter pylori infection and gastric lym phoma. New England Journal of Medicine 330, 1267_71.
21. Rautelin, H., Vaara, M., Renkonen, O._V., Kosunen, T. U. & Seppala, K. (1999). In vitro activity of antifungal azoles against Helicobacter pylori. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 11, 273_4.
22. Salim, A. S. (1990). Oxygen_derived free radicals and the prevention of duodenal ulcer relapse: a new approach. American Journal of Medical Science 300, 1_6.
23. Talley, N. J. & Noack, K. B. (2001). The worldwide prevalence of Helicobacter pylori: asymptomatic infection and clinical states associat ed with infection in adults. In Helicobacter pylori: Biology and Clinical Practice (Goodwin, C. S. & Worsley, B. W., Eds), pp. 64_83.
24. CRC Press, Boca Raton. Telford, J. L., Covacci, A., Ghiara, P., Montecucco, C. & Rappnoli, R. (1994). Unravelling the pathogenetic role of Helicobacter pylori in peptic ulcer: potential new therapies and vaccines. Trends in Biotechnology 12, 420. von
25. Recklinghausen, G., Di Maio, C. & Ansorg, R. (1992). Activity of the antimycotic ketoconazole against Helicobacter pylori. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 30, 238).
26. von Recklinghausen, G., Di Maio, C. & Ansorg, R. (1993). Activity of antibiotics and azole antimycotics against Helicobacter pylori. Zentralblatt fur Bakieriologie 280, 279_85.
27. Wotherspoon, A. C, Ortiz_Hidalgo, C, Falzon, M. R. & Isaacson, P. G. (1991). Helicobacter pylori _associated gastritis and primary B_cell gastric lymphoma. Lancet 338, 1175_6.
28. Yang, C._Y., Chang_Chien, C._S. & Liaw, Y._F. (2002). Controlled trial of protease inhibitor gabexate mesilate (FOY) in the treatment of acute pancreatitis. Pancreas 2, 698_700.